Терлецкий, В. П.     К вопросу генотипирования штаммов бактерий родов Pectobacterium и Pseudomonas - возбудителей бактериозов картофеля / В. П. Терлецкий, А. М. Лазарев // Цитология и генетика. - 2019. - Том 53, N 3. - С. 38-46 MeSH-головна: РАСТЕНИЙ БОЛЕЗНИ -- PLANT DISEASES (микробиология) КАРТОФЕЛЬ -- SOLANUM TUBEROSUM (микробиология) ПСЕВДОМОНАДЫ -- PSEUDOMONAS (генетика) PECTOBACTERIUM -- PECTOBACTERIUM (генетика) ГЕНОТИПИРОВАНИЯ МЕТОДЫ -- GENOTYPING TECHNIQUES Анотація: Молекулярно-генетические приемы исследований дают возможность идентифицировать фитопатогены c полной характеристикой их наследственного материала. Предлагаемый нами метод генотипирования основан на использовании двух эндонуклеаз рестрикции для расщепления геномной ДНК бактерии. Присутствующая в реакционной смеси ДНК-полимераза (Taq) обеспечивает мечение фрагментов ДНК биотинилированным дезоксицитозинтрифосфатом (Bio-dCTP). Метка включается только в ДНК, имеющей 3-штрих усеченные концы, образуемые первым ферментом. Вторая эндонуклеаза рестрикции дает только тупые концы фрагментов, не способных включать метку. В результате ДРИМ-реакции (двойного расщепления и избирательного мечения) на фильтре визуализируют 20–50 четко различимых фрагментов ДНК, количество и распределение которых характерно для каждого бактериального штамма. Работа осуществлена с использованием двух пар ферментов рестрикции – XbaI/DraI и XbaI/Eco24I; ее результаты указывают на одинаковую дискриминационную способность ферментов. Некоторое преимущество имеет комбинация XbaI/DraI, позволяющая увидеть различия генетических профилей в области длинных фрагментов ДНК. Генетический профиль Ps. fluorescens 894, выявляемый с помощью пары ферментов BcuI-Eco32, существенно отличался от профиля Ps. xanthochlora, что и следовало ожидать при сравнении этих двух видов. В целом, результаты генотипирования коррелируют с материалами исследований о происхождении бактериальных штаммов. В частности, микроорганизмы с одинаковым генетическим профи-лем Д822/Д828, Г399/Г400, С960/С966 получены из пораженных клубней одного опытного поля, что допускает возможность контактного распространения патогена. В отдельных случаях отмечается идентичность штаммов, несмотря на их разное географическое происхождение. Этот факт подтверждает контаминацию, произошедшую ранее при использовании зарубежного посадочного картофеля Молекулярно-генетичні прийоми досліджень дають змогу ідентифікувати фітопатогени з повною характеристикою їх спадкового матеріалу. Пропонований нами метод генотипування заснований на використанні двох ендонуклеаз рестрикції для розщеплення геномної ДНК бактерії. Присутня в реакційній суміші ДНК-полімераза (Taq) забезпечує мічення фрагментів ДНК біотинильованим дезоксицитозинтри-фосфатом (Bio-dCTP). Мітка включається тільки в ДНК, що має 3ʹ усічені кінці, утворені першим ферментом. Друга ендонуклеаза рестрикції дає тільки тупі кінці фрагментів, які не здатні включати мітку. В результаті ПРВМ-реакції (подвійного розщеплення і вибіркового мічення) на фільтрі візуалізують 20–50 чітко помітних фрагментів ДНК, кількість і розподіл яких характерні для кожного штаму бактерій. Робота здійснена з використанням двох пар ферментів рестрикції – XbaI/DraI і XbaI/Eco24I; її результати вказують на однакову дискримінаційну здатність ферментів. Деяку перевагу має комбінація XbaI/DraI, що дозволяє поба-чити відмінності генетичних профілів в ділянці довгих фрагментів ДНК. Генетичний профіль Ps. fluorescens 894, що виявляються за допомогою пари ферментів BcuI/Eco32, істотно відрізнявся від профілю Ps. xanthochlora, що і слід було очікувати при порівнянні цих двох видів. У цілому, результати генотипування корелюють з матеріалами досліджень про походження бактеріальних штамів. Зокрема, мікроорганізми з однаковим генетичним профілем Д822/Д828, Г399/Г400, С960/С966 отримані з уражених бульб одного дослідного поля, що допускає можливість контактного поширення патогену. В окремих випадках відзначається ідентичність штамів, незважаючи на їх різнe географічне походження. Цей факт підтверджує контамінацію, що сталася раніше при використанні зарубіжної посадкової картоплі Molecular genetic research methods make it possible to identify phytopathogens with comprehensive characteristics of their hereditary material. Our method of genotyping phytopathogenic bacteria is based on the use of two restriction endonucleases for digesting the genomic DNA (DDSL). The Taq DNA polymerase included in the reaction mixture provides labeling of DNA fragments with biotinylated deoxycytosinetriphosphate (Bio-dCTP). The label is incorporated only into DNA having 3-prime recessed ends formed by the first enzyme. The second restriction endonuclease produces only blunt ends of fragments that are unable to incorporate a label. As a result of the DDSL reaction, 20–50 distinct DNA fragments are visualized on the filter, the amount and distribution of which is characteristic for each bacterial strain. The work was carried out using two pairs of restriction enzy-mes – XbaI/DraI and XbaI/Eco24I; the results indicate the same discriminatory ability of these combinations of enzymes. Some advantage is noted for the combination XbaI/DraI, which allows detecting differences in genetic profiles in the region of longer DNA fragments. The genetic profile generated by enzyme pair BcuI-Eco32I in Ps. fluorescens 894, was significantly different from that of Ps. xanthochlora, which could be anticipated considering that these are two different bacterial species. In general, genotyping data correlate with data concerning the origin of bacterial strains. In particular, strains with the same genetic profile, D822 and D828, G399 and G400, C960 and C966 were obtained from affected tubers of the same experimental fields, which allow the possibility of contact spread of the pathogen. In some cases, the identity of genetic profiles is demonstrated, despite their different geographic origins. This fact confirms the contamination that occurred in the past during the exchange of seed material Дод.точки доступу: Лазарев, А. М. Вільних прим. немає